Новини - Моніторинг рівня розчиненого кисню в процесі біофармацевтичної ферментації

Що таке розчинений кисень?

Розчинений кисень (РК) стосується молекулярного кисню (O_₂), що розчиняється у воді. Він відрізняється від атомів кисню, присутніх у молекулах води (H_₂O), оскільки він існує у воді у формі незалежних молекул кисню, що походять з атмосфери або утворюються в результаті фотосинтезу водними рослинами. На концентрацію розчиненого кисню впливають різні фактори, включаючи температуру, солоність, потік води та біологічну активність. Таким чином, вона служить критичним показником для оцінки стану здоров'я та забруднення водного середовища.

Розчинений кисень відіграє життєво важливу роль у сприянні мікробному метаболізму, впливаючи на клітинне дихання, ріст та біосинтез продуктів метаболізму. Однак, вищі рівні розчиненого кисню не завжди корисні. Надлишок кисню може призвести до подальшого метаболізму накопичених продуктів і потенційно спричинити токсичні реакції. Оптимальні рівні розчиненого кисню варіюються для різних видів бактерій. Наприклад, під час біосинтезу пеніциліну розчинений кисень зазвичай підтримується приблизно на рівні 30% насичення повітрям. Якщо розчинений кисень падає до нуля та залишається на цьому рівні протягом п'яти хвилин, утворення продукту може бути значно порушено. Якщо цей стан триває протягом 20 хвилин, можуть виникнути незворотні пошкодження.

Наразі найпоширеніші датчики розчиненого кисню (РК) можуть вимірювати лише відносне насичення повітрям, а не абсолютну концентрацію розчиненого кисню. Після стерилізації культурального середовища проводиться аерація та перемішування, доки показання датчика не стабілізуються, після чого значення встановлюється на 100% насичення повітрям. Подальші вимірювання під час процесу ферментації базуються на цьому орієнтирі. Абсолютні значення РК неможливо визначити за допомогою стандартних датчиків, і для цього потрібні більш просунуті методи, такі як полярографія. Однак вимірювань насичення повітрям, як правило, достатньо для моніторингу та контролю процесів ферментації.

У ферментері рівні розчиненого розчину можуть відрізнятися в різних регіонах. Навіть коли в певний момент отримано стабільні показники, у певних середовищах для культивування все ще можуть спостерігатися коливання. Більші ферментери, як правило, демонструють більші просторові варіації рівнів розчиненого розчину, що може суттєво впливати на ріст і продуктивність мікробів. Експериментальні дані показали, що, хоча середній рівень розчиненого розчину може становити 30%, продуктивність ферментації за коливальних умов значно нижча, ніж за стабільних. Тому при збільшенні масштабу ферментерів, окрім врахування геометричної та енергетичної подібності, мінімізація просторових варіацій розчиненого розчину залишається ключовою метою дослідження.

Чому моніторинг розчиненого кисню є важливим у біофармацевтичній ферментації?

1. Підтримувати оптимальне середовище для росту мікроорганізмів або клітин
Промислова ферментація зазвичай відбувається за участю аеробних мікроорганізмів, таких як кишкова паличка та дріжджі, або клітин ссавців, таких як клітини яєчників китайського хом'яка (CHO). Ці клітини функціонують як «робітники» в системі ферментації, потребуючи кисню для дихання та метаболічної активності. Кисень служить кінцевим акцептором електронів в аеробному диханні, забезпечуючи вироблення енергії у формі АТФ. Недостатнє постачання кисню може призвести до клітинної задухи, зупинки росту або навіть загибелі клітин, що зрештою призводить до невдалого завершення ферментації. Моніторинг рівнів розчиненого кисню гарантує, що концентрація кисню залишається в оптимальному діапазоні для сталого росту та життєздатності клітин.

2. Забезпечити ефективний синтез цільових продуктів
Мета біофармацевтичної ферментації полягає не лише у стимулюванні проліферації клітин, а й у сприянні ефективному синтезу цільових продуктів, таких як інсулін, моноклональні антитіла, вакцини та ферменти. Ці біосинтетичні шляхи часто вимагають значних витрат енергії, переважно одержуваної в результаті аеробного дихання. Крім того, багато ферментативних систем, що беруть участь у синтезі продуктів, безпосередньо залежать від кисню. Дефіцит кисню може порушити або знизити ефективність цих шляхів.

Більше того, рівні розчиненого розчину діють як регуляторний сигнал. Як надмірно високі, так і надмірно низькі концентрації розчиненого розчину можуть:
- Змінити клітинні метаболічні шляхи, наприклад, перейшовши від аеробного дихання до менш ефективного анаеробного бродіння.
- Запускають клітинні стресові реакції, що призводять до утворення небажаних побічних продуктів.
- Впливають на рівні експресії екзогенних білків.

Точно контролюючи рівні розчиненого розчину на різних стадіях ферментації, можна спрямовувати клітинний метаболізм до максимального синтезу цільового продукту, тим самим досягаючи ферментації з високою щільністю та високим виходом.

Вступ до схеми потоку води для біофармацевтичних препаратів

3. Для запобігання дефіциту або надлишку кисню
Киснева недостатність (гіпоксія) може мати серйозні наслідки:
- Ріст клітин і синтез продуктів припиняються.
- Метаболізм переходить до анаеробних шляхів, що призводить до накопичення органічних кислот, таких як молочна та оцтова кислоти, які знижують pH культурального середовища та можуть отруювати клітини.
- Тривала гіпоксія може спричинити незворотні пошкодження, при цьому відновлення може бути неповним навіть після відновлення постачання кисню.

Надлишок кисню (перенасичення) також створює ризики:
- Це може викликати оксидативний стрес та утворення активних форм кисню (АФК), які пошкоджують клітинні мембрани та біомолекули.
- Надмірна аерація та перемішування збільшують споживання енергії та експлуатаційні витрати, що призводить до непотрібних втрат ресурсів.

4. Як критичний параметр для моніторингу в реальному часі та керування зворотним зв'язком

Розчинений розчинений розчин (РК) – це параметр у режимі реального часу, безперервний та комплексний, який відображає внутрішні умови системи ферментації. Зміни рівнів РК можуть чутливо вказувати на різні фізіологічні та операційні стани:
- Швидкий ріст клітин збільшує споживання кисню, що призводить до зниження рівня розчиненого кисню.
- Виснаження або пригнічення субстрату уповільнює метаболізм, зменшуючи споживання кисню та спричиняючи підвищення рівня розчиненого кисню.
- Забруднення сторонніми мікроорганізмами змінює схему споживання кисню, що призводить до аномальних коливань розчиненого кисню та служить раннім сигналом попередження.
- Несправності обладнання, такі як вихід з ладу мішалки, засмічення вентиляційної труби або забруднення фільтра, також можуть призвести до аномальної поведінки розчиненого розчину.

Інтегруючи моніторинг розчиненого розчину в режимі реального часу в автоматизовану систему керування зі зворотним зв'язком, можна досягти точного регулювання рівнів розчиненого розчину за допомогою динамічного налаштування наступних параметрів:
- Швидкість перемішування: Збільшення швидкості покращує контакт газу з рідиною, розбиваючи бульбашки, тим самим підвищуючи ефективність перенесення кисню. Це найпоширеніший та найефективніший метод.
- Швидкість аерації: регулювання швидкості потоку або складу вхідного газу (наприклад, збільшення частки повітря або чистого кисню).
- Тиск у балоні: Підвищення тиску збільшує парціальний тиск кисню, тим самим покращуючи розчинність.
- Температура: Зниження температури збільшує розчинність кисню в культуральному середовищі.

Рекомендації BOQU щодо продуктів для онлайн-моніторингу біологічної ферментації: